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雷火亚洲电竞平台官网-小鼠结肠平滑肌细胞的背景与应用及作用研究!

2023-09-30


1、布景小鼠结肠光滑肌细胞分手自结肠组织;结肠在右髂窝内续在盲肠,在第3骶椎平面毗连直肠。结肠分升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠4部门,年夜部门固定在腹后壁,结肠的摆列酷似英文字母“M”,将小肠包抄在内。结肠横切面由内到外顺次为:黏膜(上皮层、固有层、黏膜肌层),雷火亚洲电竞平台官网黏膜基层(松散结缔组织),肌层(内环形、外纵行两层光滑肌),外膜(纤维膜或浆膜)。结肠光滑肌细胞首要散布在黏膜肌层和肌层的内环形、外纵行光滑肌;结肠活动少而迟缓,对刺激的反映也较缓慢。结肠光滑肌在食品消化与接收、肠道活动和物资排泄、引发全身炎症反映和细胞内旌旗灯号转导路子等研究中起侧重要的感化。结肠光滑肌细胞原代分手培育3天后,可见细胞贴壁舒展,细胞形态巨细纷歧,呈梭形、不法则雷火电竞网站形、三角形或扇形,核卵圆形、居中;2周后细胞会合,大都细胞舒展呈长梭形,胞浆丰硕,有分枝状崛起,细胞平行摆列成单层或部门区域多层堆叠发展,凹凸升沉;细胞密度低时,常交叉成网状;密度高时,则摆列为漩涡状或栅栏状。传代后细胞发展较快,4-6天便可会合,并连结上述形态学特点和发展特点。结肠光滑肌活动活性遭到神经递质、胃肠激素和药物等身分的调理。跟着现代胃肠动力学研究的进展,对胃肠活动的研究已从器官、组织程度成长到细胞、份子程度,要求在胃肠道单个光滑肌细胞标本上来完成各类电心理、药理和份子生物学等尝试。体外培育细胞,因为影响身分单一,是研究细胞功能和响应的细胞旌旗灯号转导机制的根本。2、小鼠结肠光滑肌细胞培育操作1)苏醒小鼠结肠光滑肌细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中敏捷摇摆解冻,插手4mL培育基夹杂平均。在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育基后吹匀。然后将所有细胞悬液插手培育瓶中培育留宿(或将细胞悬液插手10cm皿中,插手约8ml培育基,培育留宿)。第二天换液并查抄细胞密度。2)小鼠结肠光滑肌细胞传代:假如细胞密度达80%-90%,便可进行传代培育。1.弃去培育上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)在培育瓶中,置在37℃培育箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下不雅察细胞消化环境,若细胞年夜部门变圆并脱落,敏捷拿回操作台,轻敲几下培育瓶后加少许培育基终止消化。3.按6-8ml/瓶补加培育基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育液后吹匀。4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培育基的新皿中或瓶中。3)小鼠结肠光滑肌细胞冻存:待细胞发展状况杰出时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;1、细胞冻存时,弃去培育基后,PBS清洗一遍后插手1ml胰酶,细胞变圆脱掉队,插手1ml含血清的培育基终止消化,可以使用血球计数板计数。2、4 min 1000rpm离心去失落上清。加1ml血清重悬细胞,按照细胞数目插手血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低在1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,留意冻存管做好标识。3.、将冻存管置在法式降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时今后转入液氮灌贮存。记实冻存管位置以便下次拿取。3、利用小鼠结肠光滑肌细胞可以用在脑源性神经营养因子对小鼠结肠光滑肌细胞的重构感化:经由过程引入BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠,不雅察BDNF+/-小鼠结肠SMC超微布局的改变和结肠组织光滑肌α-肌动卵白(smooth muscle a-actin,α-SMA)表达程度的转变,并利用BDNF和TrkB受体阻滞剂(K252a)体外干涉干与C57bl/6小鼠结肠SMC,检测SMC形态和α-SMA、相干旌旗灯号通路卵白、细胞内钙离子浓度的转变,研究BDNF是不是可以直接引发小鼠结肠光滑肌细胞的重构,进而影响肠道动力。方式:1、尝试选用健康野生型C57B1/6(BDNF+/+)小鼠和BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠:电镜检测BDNF+/+小鼠和BDNF+/-小鼠结肠光滑肌细胞超微布局的差别;操纵Western blotting方式检测BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠α-SMA表达程度的差别。2、培育原代小鼠结肠光滑肌细胞:细胞免疫荧光判定原代结肠SMC是不是有TrkB受体的表达;BDNF和K252a别离干涉干与结肠光滑肌细胞,按照干涉干与分歧,分为三组①对比组②BDNF组K252a组,三组细胞均在干涉干与24小时落后行后续尝试;细胞免疫荧光检测BDNF和K252a干涉干与后结肠光滑肌细胞形态的改变;Western blotting检测干涉干与后SMC中α-SMA,TrkB-PLC-Ca2+旌旗灯号通路卵白表达量的转变;钙离子成像检测BDNF和K252a干涉干与下SMC中细胞内钙离子浓度的瞬时改变。3、统计学处置:采取SPSS 17.0软件,计量资料以x±s暗示。BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠结肠组织α-SMA表达程度、干涉干与前后细胞内钙离子相对荧光强度值的比力采取自力样本t查验;BDNF和K252a干涉干与SMC,对比组、BDNF组和BDNF+K252a组细胞核巨细、细胞密度、α-SMA表达程度、TrkB旌旗灯号通路卵白表达程度整体采取单身分方差阐发,若整体差别有统计学意义,以Bonferroni法进行组间两两比力。P<0.05为差别有统计学意义。成果:1、与BDNF+/+小鼠比拟,BDNF+/-小鼠结肠光滑肌细胞细胞间隙增宽,充填了年夜量的胶原纤维;光滑肌细胞的鸿沟呈多个球状崛起;胞体内肌丝的密度削减;2、与BDNF+/+小鼠比拟,BDNF+/-小鼠结肠α-SMA表达程度较着下降;3、小鼠原代结肠SMC表达TrkB受体;4、在BDNF感化下,免疫荧光成果显示SMC细胞核体积增年夜,细胞密度增添,骨架卵白荧光强度加强,BDNF+K252a干涉干与组细胞的形态改变相反;5、BDNF组SMC中α-SMA卵白表达程度较着高在对比组和BDNF+K252a组;6、BDNF组结肠光滑肌细胞中TrkB-PLC-Ca2+旌旗灯号通路卵白表达程度较着升高,且在BDNF干涉干与下SMC内钙离子浓度较着升高,K252a可阻断以上转变。结论:1、BDNF+/-小鼠与BDNF+/+小鼠比拟,结肠光滑肌细胞的超微布局和功能均产生了改变。2、小鼠原代结肠光滑肌细胞表达TrkB受体,且BDNF干涉干与SMC后,小鼠结肠SMC的形态和功能均产生了改变,K252a可以阻断以上转变。3、BDNF可能经由过程TrkB-PLC-Ca2+旌旗灯号通路引发小鼠结肠光滑肌细胞的重构,进而影响肠道动力。北京百欧博伟生物手艺有限公司的微生物菌种查询网供给微生物菌种收藏、测序、采办等办事,是中国微生物菌种收藏中间的办事平台,而且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培育基为一体的年夜型微生物查询类网雷火电竞网站官网入口站,自设装备和手艺的微生物菌种收藏中间!接待泛博客户来询!下载附件-雷火电竞网站



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